La tuberculosis en mamíferos: Zoonosis.

 

LA TUBERCULOSIS EN MAMÍFEROS: ZOONOSIS

Ángel Tato Jiménez, Veterinario Titular

Doctor en Veterinaria

Miembro de SOCIVESC

Las micobacterias patógenas y especialmente las tuberculosas, se han adaptado a los animales mediante mutaciones, que les permiten sobrevivir en distintas especies, en las cuales pueden mostrar una virulencia distinta a la expresada en la especie humana. Todos los miembros del Mycobacterium tuberculosis complex (CMTB) provienen de un antecesor común hace entre 20000 y 35000 años (Brosch et al., 2002; Gutierrez et al., 2005). Así M, microti se ha adaptado a ratones y gatos (Smith et al., 2009); M. mungi se ha adaptado a la mangosta anillada (Alexander et al., 2010); el bacilo de Dassie y M. orygis, a los damanes, (Mostowy et al., 2004); Mycobacterium pinnipedii en leones marinos (Cousins et al., 2003), o M. bovis en vacas, ciervos y tejones, suidos, etc  (Michel et al., 2003). Curiosamente la adaptación de M. tuberculosis a la especie humana, aunque frecuentemente aislado de otras especies (gorilas, elefantes, perros) conlleva una atenuación de su virulencia para las otras, como bovinos, mientras que M. bovis ha exaltado su virulencia para vacas, conejos de indias y cabras (Dunn et al., 1995; Nedeltchey et al., 2009; Whelean et al., 2010), afectando ocasionalmente a humanos inmunocompetentes (Benítez, 2015). En definitiva, la co-evolución de patógenos tan versátiles como las micobacterias del CMTB con huéspedes susceptibles en condiciones ambientales determinadas tiene un impacto duradero y poderoso en su adaptación a los  mismos de forma beneficiosa para su supervivencia como especie.

Así, en estas especies, se registran progresivamente más hospedadores nuevos. Paralelamente se están observando en humanos y también en otras especies numerosos casos de TBC debidos a fenómenos de reactivación de focos silentes. Se sabe que el continuo contacto con micobacterias, puede modificar el estatus inmune del individuo, cambiando de un perfil TH1 (protector) a otro TH2. En muchos sentidos convendría valorar el papel de M. bovis e incluso de otras especies del CMTB sobre la especie humana, bien por la posible aparición en el próximo decenio de casos debidos a infecciones ocurridas en la actualidad; o bien por el posible “despertar” de TBCs “dormidas”, por contactos inmunológicamente activos, que podrían cambiar el perfil TH1 al TH2.

Miembros del complejo Tuberculosis:

Mycobacterium tuberculosis (Koch, 1882)

Mycobacterium canetti (van Soolingen, 1997)

Mycobacterium africanum (Castets, 1968)

Mycobacterium bovis (Lessel y Karlson, 1970)

Mycobacterium bovis BCG (Calmette y Guérin, 1921)

Mycobacterium microti (Wells, 1937)

Mycobacterium caprae (Aranaz, 1999)

Dassie bacillus (Smith, 1960)

Mycobacterium pinnipidii (Cousins, 2003)

Mycobacterium mungi (Alexander, 2010)

Mycobacterium orygis (van Ingen, 2012)

Mycobacterium suricattae  (Parsons et al., 2013)

Comparten por encima del 99% de homología de sus DNAs, conteniendo alrededor del 65% de contenido en G+C y la misma secuencia de la fracción 16S de su RNAr (Sreevatsan et al., 1997)

• Mycobacterium tuberculosis sensu estricto (de aquí en adelante cuando digamos M. tuberculosis nos referiremos al M. tuberculosis sensu estricto, denominando a las demás micobacterias por su nombre taxonómico específico) afecta principalmente a primates, y es responsable de la mayoría de los casos de tuberculosis en humanos. Sin embargo, también ha sido encontrado en el ganado bovino (Prasad et al., 2005; Srivastava et al., 2008; Fetene et al.., 2009) y caprino (Cadmus et al., 2009), en cerdos (Thoen, 1999; Mohamed et al., 2009), en gatos y perros (Clercx et al., 1992; Aranaz et al., 1996b; Erwin et al., 2004), aves (Hoop et al., 1996; Schmidt et al., 2008), y varias especies de animales salvajes, incluyendo algunas de las que se encuentran en los parques zoológicos (Montali et al., 2001; Alexander et al., 2002; Une y Mori, 2007).
• M. bovis tiene el espectro mas amplio de especies susceptibles, afecta a vacas, búfalos, bisontes, cabra, oveja, cerdo, perro (Ellis et al., 2006; Shrikrishna et al., 2009), gatos (Aranaz et al., 1996b; Monies et al., 2000) caballos (Monreal et al., 2001); también afecta a zorros, ciervos, gamos, jabalíes, tejones, zarigüellas, linces, liebres, y primates no humanos, entre otros (Gallagher y Clifton-Hadley, 2000; O'Brien et al., 2002; Aranaz et al., 2004a; Corner, 2006; Ryan et al., 2006; Une y Mori, 2007). También afecta al hombre debido al carácter zoonósico de la enfermedad (Dankner et al., 1993; Cosivi et al., 1998; Michel et al., 2010).
• M. caprae afecta a bovino, ovino y porcino en contacto estrecho con las cabras (Aranaz et al., 1996a; Aranaz et al., 1999; Duarte et al., 2008; Boniotti et al., 2009). Al igual que ocurre con M. bovis, también se han aislado M. caprae en animales salvajes, tales como el ciervo y el jabalí (Gortázar et al., 2005; Parra et al., 2005). De igual modo, también se han identificado casos de tuberculosis en humanos producidos por M. caprae, (Gutiérrez et al., 1997; Prodinger et al., 2002; Kubica et al., 2003).
• M. africanum, causante de infecciones en hombre y otros primates (Thorel, 1980), también ha sido aislado de algunos casos de tuberculosis en ganado vacuno  (Rahim et al., 2007)

ZOOANTROPONOSIS Y ANFIXENOSIS

Nos referimos en este apartado a la infección micobacteriana de animales a partir del hombre; aplicando el término de anfixenosis, cuando la infección puede correr en ambos sentidos (sabemos que los elefantes se contagian de personas, pero a la vez excretan M. tuberculosis, ya que contagian a jirafas; por lo que las personas de su entorno serían susceptibles de ser infectadas por ellos. Algo semejante puede suceder con los suidos, que son capaces (al menos algunos individuos, de excretar bacilos tuberculosos por vía fecal, sin mostrar lesiones macroscópicas.

La susceptibilidad a la infección por M. tuberculosis varía significativamente entre las distintas especies de animales no humanos. El macaco rhesus y el macaco de cola de cerdo, son las especies más susceptibles (Ghodbane y Drancourt, 2013). Los elefantes también son muy susceptibles, así como hámsteres, cerdos y cobayas. Los cánidos, focas, tapires, rinocerontes, ratas y ratones muestran una susceptibilidad intermedia; y son bastante resistentes a la enfermedad bovinos, felinos, equinos, ungulados, conejos, aves y reptiles (Vogelnest et al., 2015).

En alguna ocasión la aparición de la enfermedad en animales de compañía es un reflejo de la enfermedad en la población humana que les rodea y ocasionalmente conlleva al diagnóstico de la enfermedad en sus dueños (Hawthorne y Lauder, 1962; Erwin et al., 2004)

En el caso concreto de los bovinos, hay que diferenciar (por la existencia de campañas de lucha contra la TBC bovina) entre infección por M. tuberculosis, que no es tan infrecuente en esta especie y enfermedad TBC debida a esta micobacteria (bien porque los bovinos son bastantes resistentes, o bien porque el desarrollo de la respuesta inmunitaria específica puede contener las micobacterias en el lugar de infección). Diferentes estudios ponen de manifiesto que la infección por M. tuberculosis solo causa el 1% de las TBC detectadas en bovinos (Pavlik et al., 2003; Ocepek et al., 2005; Cadmus et al., 2006; Une y Mori, 2007); si bien es cierto que las técnicas de diagnóstico utilizadas en muchas ocasiones, no permiten la correcta identificación micobacteriana (Ayele et al., 2004). Sin embargo en algunos países de África, como Argelia y Sudán las tuberculosis en bovinos debidas a M. tuberculosis, llegan al 6'2 y 7'4% respectivamente; en Etiopía, Fetene et al. (2009) aislaron M. tuberculosis en el 15’4% de las muestras investigadas. Lógicamente estos altos valores de infección y/o TBC bovina por M. tuberculosis se correlacionan directamente con la elevada prevalencia de TBC humana en el entorno (Dye, 2006; Dye et al., 2009). De hecho, Regassa et al., (2008) ya demostraron que la prevalencia de TBC en vacas debida a M. tuberculosis era tres veces superior cuando el personal de la explotación presentaba una tuberculosis activa que cuando la infección era latente. En India, Prasad et al. (2005), pusieron en evidencia una infección del 30'8% en vacas, debida a  M. tuberculosis. En China, también ha sido aislado este patógeno en explotaciones ganaderas, identificándose M. tuberculosis en un 15,8% (6/38) de los animales infectados (Chen et al., 2009). Romero et al (2011), informan de la infección por M. tuberculosis en tres terneras de otras tantas granjas españolas. La investigación epidemiológica puso en evidencia el origen humano de la infección, por unos inmigrantes de países del este de Europa.

El estudio mediante biología molecular (espoligotipado y análisis de las repeticiones en tándem de múltiples loci) de estos aislamientos pone en evidencia la coincidencia de perfiles genéticos entre los aislamientos procedentes de estos animales y los más frecuentemente obtenidos entre la población humana de la zona. En Europa occidental  existe constancia de la infección por M. tuberculosis  en ganado bovino del Reino Unido, en la década de los años 50, donde se detectó la infección en un total de cinco explotaciones (Leslie, 1960).

M. tuberculosis también ha sido aislado e identificado como agente causal de la tuberculosis en otras especies animales: cabras en Nigeria (Cadmus et al., 2009) y los cerdos en Egipto, Bosnia, Noruega, Inglaterra, Alemania, Eslovaquia, Polonia (Pavlik et al., 2003; Mohamed et al., 2009).

Entre los factores que favorecen las condiciones de transmisión del hombre a los animales se encuentran la proximidad y la frecuencia de contacto entre ambos. Por lo tanto, la infección causada por M. tuberculosis ocurre con más frecuencia en animales que están en contacto directo con los humanos, siendo los animales que están en cautividad los que presentan un mayor riesgo de contagio (Vogelnest et al., 2015; Montali et al., 2001). Durante las últimas décadas se han descrito por todo el mundo bastantes casos de tuberculosis en elefantes de zoológicos o granjas exóticas, hallándose en todos los casos una fuente de infección humana (Michalak et al., 1998; Davis, 2001; Oh et al., 2002; Payeur et al., 2002; Lewerin et al., 2005).

La infección por M. tuberculosis también ha sido descrita en animales de compañía, especialmente en perros. En un estudio llevado a cabo por Liu y colaboradores, M. tuberculosis fue aislado de un 75% de los perros con tuberculosis y en más de un 88% de los casos hubo un contacto con pacientes con una tuberculosis activa (Liu et al., 1980). También se ha detectado la presencia de M. tuberculosis en aves psitácidas (Schmidt et al., 2008); y en monos (Alfonso et al., 2004; Une y Mori, 2007).

Se ha descrito la transmisión interespecífica de M. tuberculosis en especies animales, como fue el caso de contagio entre elefantes y jirafas de un zoo de Suecia (Lewerin et al., 2005).

Aunque es un hallazgo poco común, también se ha descrito la infección tuberculosa en un mismo animal producida por dos especies del complejo M. tuberculosis. En un estudio de tuberculosis realizado en la India sobre una única explotación bovina observaron 52 animales infectados (92,8%). Mediante una PCR anidada identificaron los agentes etiológicos, aislando M. bovis en el 28,8% de las muestras, M. tuberculosis en el 30,8%, y ambas especies (infección mixta) en un 38,5% (Prasad et al., 2005).

ZOONOSIS

La transmisión de M. bovis puede ocurrir entre animales, de animales a humanos, de humanos a animales  y raramente entre humanos.

M. bovis es causante del 2% de las TBCs humanas en el mundo (Müller et al., 2013).  Otros autores elevan esta tasa hasta el 5-10% de media (Wilkins et al., 2008) en algunos países en vías de desarrollo, como Tanzania; con picos de incidencia de entre el 18 y el 30% (Cleaveland et al., 2007).  De los pacientes expuestos a M. bovis, al igual que ocurre con M. tuberculosis, solo unos pocos desarrollarán la enfermedad, generalmente como resultado de una reactivación (Sunder et al., 2009). En humanos puede producir TBCs con cuadros clínico-lesionales indistinguibles de los debidos a M. tuberculosis.

En Europa esta infección es poco común, habiéndose notificado en 2013 únicamente 134 casos en toda la UE. La mayoría de los casos se registraron en Irlanda, Alemania, Reino Unido y España (EFSA y ECDC, 2015). Sin embargo, antes de la implantación de los programas de erradicación y de los controles en matadero y de la instauración del tratamiento térmico de la leche y productos lácteos, la prevalencia era del 30% (O'Reilly y Daborn, 1995). Fuera de la UE, los países con mayor prevalencia son Méjico, Uganda y Nigeria, con valores que oscilan del 5 al 13,8% (Perez-Lago et al., 2014b). Estas cifras pueden estar infraestimadas debido a que la enfermedad es clínica, radiológica e histopatológicamente indistinguible de la causada por M. tuberculosis. En España entre 2004 y 2007, el laboratorio nacional de referencia registró 89 casos de TBC humana debida a M. bovis y  21 por M. caprae, que corresponden al 1.9% y 0.3% del total de TBCs humanas (debidas a Complejo M. tuberculosis) (Rodríguez et al., 2009). En Extremadura, la tesis Doctoral de José Manuel Benítez Medina (2015) ha puesto en evidencia la existencia de 5 casos de TBCs humanas debidas a M. bovis, cuyos espoligotipos coinciden  con los encontrados en animales domésticos y salvajes de la región.

La ruta clásica de transmisión de M. bovis al hombre ha sido la digestiva, fundamentalmente a partir de productos lácteos  crudos. También hay que destacar la inhalación de bacilos, a partir de aerosoles (Thoen y Barletta, 2006).

Hoy hay que considerar otros factores favorecedores de la primoinfección por M. bovis o de la reactivación de focos silentes, dependientes de la especie infectada, en este caso humano, cuales son los factores de disminución de la inmunidad, bien por enfermedad, bien por terapéuticas, bien por el declive asociado a la edad.

Se ha demostrado la transmisión humano/humano de M. bovis, así como infecciones nosocomiales caracterizadas por una importante multidrogorresistencia (Samper et al., 2007) y generalmente, aunque no siempre, relacionadas con afectados por SIDA, en los que produce elevada mortalidad (Blázquez et al., 1997; Evans et al., 2007; Guerrero et al., 1997;  Samper et al., 1997, 2007). Guerrero et al. (2009) en su estudio llevado a cabo en España entre los años 2004-07, demuestran una letalidad del 9% (10 de 110 casos zoonósicos estudiados), todos ellos debidos a M. bovis.

En el estudio realizado por Rodríguez et al. en el año 2007, se puso de manifiesto que los casos humanos debidos a M. bovis, se concentraban en la población comprendida entre los 15 y 44 años y en los mayores de 65 años. Todo ello viene a indicar una elevada infectividad para los jóvenes, a la vez que presume la reactivación de TBCs silentes, cuyas infecciones probablemente hayan estado relacionadas con la actividad profesional.

Esto también parece constatarlo Benítez (2015), que refiere una TBC ganglionar cervical en una niña de 9 años, de origen norteafricano, lo que hace presumible que el origen de la infección sea digestivo; mientras que el resto de los pacientes presentaron formas pulmonares de la enfermedad, con edades de entre 65 y 76 años y un cuarto de 36; este último era manipulador en matadero, otro refirió ser ganadero y en los otros dos no se podía establecer relación profesional con animales; en todo caso estos últimos cuatro casos, al menos, parecen debidos a reactivación de focos silentes. La presencia latente del bacilo tuberculoso puede evidenciarse no sólo en los macrófagos de los granulomas, sino también en las células fagocíticas no profesionales. De hecho M. tuberculosis se aísla de biopsias de pulmón con una apariencia normal  (Fenhall et al., 2002; Benítez, 2015). La apoptosis permitirá la eliminación de la célula muerta y de la bacteria contenida en ella, sin apenas daño tisular. Por el contrario, la necrosis favorece el crecimiento y diseminación de Mycobacterium spp. exacerbando la inflamación y alterando el tejido circundante.

Entre 1920 y 2003 se confirmaron entre 17 y 50 casos de TBC humanas al año en el Reino Unido, debidas a M. bovis; lo que representa entre el 0'5 y el 1'5% de los casos de TBC humana diagnosticados. Esta proporción es muy similar a la del resto de países desarrollados.

En Reino Unido los casos zoonósicos de TBC se atribuyen a reactivaciones de infecciones latentes que tuvieron lugar antes de la implantación de la higienización de la leche, o a infecciones adquiridas en el extranjero. Desde 1990 solo se ha documentado un caso de TBC humana debida a M. bovis, relacionada con una fuente animal. Aunque aparentemente el riesgo zoonósico es bajo, médicos y responsables de Salud Pública advierten que debido al incremento de la TBC bovina, no puede considerarse esta enfermedad como superada y remarcan su condición de zoonosis; especialmente para la población de riesgo: consumidores de leche cruda, personal de granja y de mataderos (Rua Domenech, 2006).

Mycobacterium africanum línea 6 (L6) es un importante agente de TBC en el oeste de África, estimándose que origina mas del 40% de las TBCs pulmonares humanas (Boatema et al., 2016).

MECANISMOS MOLECULARES DE LA ADAPTACIÓN ESPECIE-ESPECÍFICA DE LAS MICOBACTERIAS DEL COMPLEJO TUBERCULOSIS

A pesar del elevado número de casos de TBC en animales debidos a M. bovis, existen   distintas evidencias que sugieren que esta micobacteria no exhibe la misma virulencia  ni infectividad para los humanos que M. tuberculosis. Indudablemente M. bovis infecta a humanos, pero no produce en ellos, o al menos no es frecuente que produzca, una infección sostenible, con transmisión horizontal en esta especie animal; algo semejante ocurre con M africanum L6 y con M. caprae. Aún teniendo en cuenta la elevada identidad genómica entre M. tuberculosis y M. bovis son patentes las  diferencias en cuanto al potencial patogénico y virulencia que presentan para distintas especies. Ello implica que las diferencias fenotípicas se deben a la distinta expresión de genes.

Entre los distintos miembros del complejo tuberculosis, existen diferencias genómicas, denominadas “Regiones de Diferencia” (RD), que consisten en deleciones y que pueden afectar a la patogenicidad intrínseca de la micobacteria y a la expresión de esa patogenicidad en las diferentes especies animales a las que infecte (Tsolaki et al., 2004; Garnier et al., 2003). Entre estas regiones de diferencia, los genes correspondientes a la Región de Diferencia 1 ejercen un control regulatorio sobre otros genes relacionados con la virulencia (Mahairas et al., 1996). En lo que respecta a M. bovis, las cepas aisladas en Argentina, Holanda, Reino Unido y España, incluyendo las de origen humano, muestran deleciones en las Regiones de Diferencia 4, 5, 6 7, 8, 9, 10, 12 y  13 (Forrellad et al., 2013).

El genoma de  M. tuberculosis complex codifica mas de 200 proteínas reguladoras, entre las que se incluyen mas de 100 reguladores transcripcionales y 11 regulones, en M. bovis, mientras que en M. tuberculosis solo son 10 (Bretl et al., 2011; Cole et al., 1998). Estos moduladores de la transcripción están implicados en la variabilidad de la virulencia que expresan unas cepas frente a otras, y sus efectos regulatorios determinan  o no el crecimiento de las distintas cepas en macrófagos, lo que se manifiesta por el incremento de la carga micobacteriana en estos (Parish et al., 2003b). Los Regulones son: PrrA/PrrB (Ewann et al., 2002), DevR (DosS-DosT/DosR) también conocido como DosR (Malhotra et al., 2004), SenX3/RegX3 (Parish et al., 2003a, 2003b), MprA/MprB (Zahrt et al., 2003,), U/U/TcrA (Hayden & Clark-Curtiss, 2004), NarL/NarS (Parish et al., 2003), KdpE/KdpD (Parish et al., 2003), TrcS/TrcR (Haydel et al., 1999), MtrB/MtrA (Zahrt & Deretic, 2001), TcrY/TcrX (Parish et al., 2003) y el PhoPR (Ludwiczak et al., 2002; Zahrt & deretic, 2001.

Una de las bases moleculares que mas influye en la diferencia es la que determina la expresión del regulon PhoPR (Perez et al., 2001), cuyos productos determinan variaciones en la contagiosidad, virulencia y patogenia de las distintas especies de micobacterias para las distintas especies de hospedadores. Los genes regulados por el regulón PhoPR son claves en la síntesis de lípidos (Walters et al., 2006; Gonzalo-Asensio et al., 2006; Frigui et al., 2008; Chesne-Seck et al., 2008; Galagan et al., 2013). Del control ejercido por el PhoPR dependen muchos factores de virulencia: Lípido F, ESAT-6, poliaciltrehalosa (PAT) y diaciltrehalosas, sulfátidos y sulfolípidos (SL) (Walters et al., 2006; Gonzalo-Asensio et al., 2006; Galagan et al., 2013; Camacho et al., 2009; Passemar et al., 2014; Goya et al., 2011). El sistema PhoPR es un regulador transcripcional de genes involucrados en la síntesis de componentes de la pared celular de M. tuberculosis complex. El hecho de que el control de las rutas de biosíntesis se efectúe por un sistema de dos componentes, permite el control coordinado de aquella, según varíen las condiciones medioambientales.

Existen al menos tres SNPs (polimorfismo de nucleótido único) que afectan a los genes regulados por PhoPR en M. africanum y que no han podido ser demostradas en M. tuberculosis (Gonzalo Asensio et al, 2014).

ESAT-6 y CFP-10 son secretadas por el sistema de secreción ESX-1 del M. tuberculosis, el cual se encuentra codificado en la región “región de diferencia 1” de su cromosoma (Millington et al., 2011). Este sistema media la exportación de factores de virulencia que permiten modular la respuesta inmune innata del hospedador en las primeras etapas de la infección (Skjot et al., 2000), por lo que su presencia resulta crítica para la virulencia de M. tuberculosis y M. bovis. Es un sistema de secreción tipo VII que permite el transporte de proteínas en la célula infectada por CMTB (Brodin et al., 2006). La actividad secretora ESX-1 es controlada por la expresión transitoria del operon espACD (Fortune et al., 2005; MacGurn et al., 2010); éste consta de 5 genes y se expresa en el fagosoma macrofágico (Rohde et al., 2007). El producto de ESX-1 regula la transcripción para el factor EspR (Hunt et al., 2012); es decir el operon espACD, está implicado en la expresión del regulón PhoP (Walters et al., 2006; Frigui et al., 2008; Chesne-Seck, 2006; Galagan et al., 2013). No obstante hay que señalar que la expresión de esta proteína no es específica de CMTB, pues se ha detectado también en M. leprae, M kansasii, M. marinum, M. szulgai, M.flavescens y M. gastri (Sorensen et al., 1995; Harboe et al. 1997). Al estar presente en tantas micobacterias patógenas y/o medioambientales, se dificulta su potencial uso como herramienta diagnóstica para TBC en mamíferos, aunque suele utilizarse en los tests IGRA, para diagnóstico de la TBC latente.

M. bovis y M. africanum L6 son deficientes en el Regulón PhoPR, debido a una mutación en sus locus phoP; que originaron cambios en la síntesis y producción de lípidos y proteínas, que habrían atenuado la patogenicidad de estas micobacterias para humanos (González-Asensio et al., 2014). No obstante, se ha comprobado que una deleción, en la Región de Diferencia 8, en M. bovis y en M. africanum L6 hace posible la restauración de la secreción de ESAT-6 por estas micobacterias, por una vía independiente del regulón PhoPR, aunque insuficiente para compensar la pérdida de virulencia de estas micobacterias para los humanos (González-Asensio et al., 2014).

La principal diferencia hallada entre las cepas de M tuberculosis (L4) y de M africanum (L6) radica en la disminución de la expresión del regulón DosR en L6 respecto a L4, que corresponden a la mutación de  genes relacionados con el regulón DosR. El regulón DosR de M. tuberculosis es  imprescindible para la adaptación micobacteriana a los ambientes pobres en oxígeno (Mehra et al., 2015; Voskuil et al., 2003; Galagan et al., 2013). Así DosR está superexpresado durante la hipoxia, al contrario que sucede en los ambientes con oxígeno suficiente (Mehra et al., 2015; Voskuil et al., 2003).

M. africanum podría tener una estrategia diferente, basada en la mutación de 5 de los 7 operones que permiten a esta micobacteria sobrevivir en el interior de los macrófagos (Gehre et al., 2013); mientras que el regulón DosR se expresaría a menor escala que en M. tuberculosis; esta menor dependencia del regulón DosR, permitiría a M. africanum una mejor adaptación a ambientes microaerófilos (Boatema et al., 2017). Así M. tuberculosis requiere condiciones de aerobiosis, mientras que los cambios genómicos en DosR del L6 permiten a M. africanum crecer en condiciones de microaerobiosis, lo que se traduce en un incremento de su capacidad para infectar y propagarse por tejidos extrapulmonares (Boatema et al., 2017).

Los componentes de la envoltura micobacteriana están implicados en los fenómenos de resistencia y virulencia. Las ceras, unidas a carbohidratos y rodeadas por una capa lipídica, constituyen un eficaz mecanismo de defensa de las micobacterias frente al huésped (Goren et al., 1976; Daffe y Etienne, 1999). El sistema de transducción de señales de dos componentes consta de una Histidino-quinasa (HK), capaz de responder a estímulos medioambientales y un regulador de respuesta (RR), que es activado por la HKT. Por lo tanto, juegan un papel fundamental en la respuesta micobacteriana a los cambios medioambientales (Walters et al., 2006; Galan and Curtiss, 1989; Groisman et al., 1989, 97, 2001; Miller et al., 1989).

Los genes estructurales dependientes del regulón PhoP pks2, papA1, mmpL8 y Rv3822, codifican respectivamente una policeto-sintetasa, una policeto-sintetasa unida a proteína, un transportador de lípidos y una proteína de secreción (Walters et al., 2006).

pks2 se induce cuando M tuberculosis está endocitado en el macrófago y produce policeto sintetasa, indispensable para la síntesis de ácidos grasos cerámico e hidroxitiocerámico, metil malonil CoA (Sirakova et al., 2001). Esos ácidos grasos multirramificados son imprescindibles para la síntesis del sulfátido SL-1. Una deficiencia en el gen pks2 se traduce en una incapacidad de M. tuberculosis para la síntesis de SL-1, aunque esto no parece afectar a la patogenicidad; por el contrario mutaciones en el gen mmlp8 coinciden con atenuaciones del crecimiento, al menos ex vivo, de M. tuberculosis (Converse et al., 2003; Rousseau et al., 2003).

Los genes corA, mgtE y ctpI codifican proteínas transportadoras de Mg2+, que es necesario para el crecimiento de M. tuberculosis y por tanto un factor de virulencia (Walters et al., 2006). En todo caso estos genes no parecen sobrexpresarse cuando hay déficit de Mg2+; según Walters et al. (2006), el déficit de Mg2+ en el medio ambiente celular implicaría una dificultad para la producción de determinados componentes de la pared micobacteriana: sulfátidos, diaciltrehalosa y poliaciltrehalosa. M. tuberculosis en el interior del fagosoma es deficitario en Mg2+, pero un aporte extra de este induce un incremento de su virulencia (Buchmeier et al., 2000).

DIFERENCIAS GÉNICAS Y FENOTÍPICAS ENTRE M. bovis y M. tuberculosis

Para comprender la filogenia del Complejo M. tuberculosis hay que revisar diferentes estudios de biología molecular: deleciones en el cromosoma (secuencias polimórficas largas), SNPs, y la variabilidad en las repeticiones directas contenidas en el locus DR (“spoligotype”) (Brosch et al., 2002; Kamerbeek et al., 1997; Mostowy y Behr, 2005; Smith, 2003). Así se puede estudiar la diferencia entre una cepa virulenta y otra atenuada y se observan regiones de polimorfismo: por ejemplo, 16 regiones ausentes en M. bovis BCG, que representan un total de 61 ORFs (Open Reading Frames: secuencias de información genética que pueden ser utilizadas para codificar aminoácidos). Nueve de estas regiones están ausentes también en cepas virulentas de M. bovis (Brosch et al., 2002).

M. bovis tiene el rango de hospedadores mas amplio de entre los miembros del complejo tuberculosis, en tanto que M. tuberculosis es el principal agente etiológico de la TBC humana. La elevada homología genómica entre ambas micobacterias y la ausencia de genes especie-específicos para M. bovis, sugieren la existencia de fenómenos epigenéticos (Garnier et al., 2003).

La homología genómica a nivel de nucleótidos, entre ambas micobacterias, llega a ser del 99'95% (Garnier et al., 2003). Sin embargo existe una expresión diferencial en 258 genes, De ellos, 95 se expresan con mayor penetración fenotípica en M. bovis, respecto de M. tuberculosis; los 163 restantes lo hacen mas en M. tuberculosis. La principal diferencia fenotípica corresponde a la expresión de proteínas involucradas en el metabolismo intermediario, proteínas que condicionan la aerobiosis, procesos que afectan a su pared celular y de las denominadas proteínas hipotéticas (Rehren et al., 2007); de entre estas últimas, es de destacar que en M. bovis hay un 20% para las que no se ha atribuido una función específica, mientras que la tasa de expresión de proteínas hipotéticas en M. tuberculosis es del 13'5% (Rehren et al., 2007). En M. bovis se expresan un mayor número de reguladores transcripcionales que en  M. tuberculosis. Sin embargo se expresan 18 genes de la familia PE/PPE en M. tuberculosis, por solo 3 en M. bovis (Rehren et al., 2007; Rohde et al., 2007).

El genoma de M. caprae, es muy parecido al de M. bovis, excepto por la presencia de varias sustituciones de nucleótidos en el gen gyrB, que no están presentes en los demás miembros del complejo tuberculosis (Aranaz et al., 2003).

Determinadas características de los genomas, como las SNPs contribuyen al polimorfismo y por tanto a explicar las diferencias entre ambas micobacterias, pero no aclaran completamente la distinta expresión fenotípica. Muchos de esos genes diferenciales codifican para los patrones de reconocimiento de la micobacteria en cuestión (Banu et al., 2002.

En el regulón PhoPR de M. bovis  existen tres mutaciones (genes oxyR, pncA, gyrB) (respecto de M. tuberculosis), que determinan su baja expresión en M. bovis, y que se traduce por la falta de algunos lípidos de la pared micobacterina (Walter et al., en 2006) y la menor secreción del antígeno ESAT-6 (González Asensio et al., en 2014). Por el contrario, seis genes relacionados con la secreción de ESAT-6 exhiben mayor expresión en M. tuberculosis que en M. bovis. (Mattow  et al., 2003; Sorensen et al., 1995; Brodin et al., 2004)

Además del PhoPR, existen varios reguladores, como las proteínas asociadas a nucleótidos Lsr2 (Gordon et al., 2010) y EspR (Raghavan et al., 2008; Blasco et al., 2012) así como los otros 10 sistema de dos componentes TCSSs (Bretl et al., 2011); de los cuales solo el U/UTcrA está presente en M. bovis y no en M. tuberculosis (Bretl et al., 2011). En todo caso esta regulación podría diferir entre los diferentes miembros del complejo tuberculosis; sería el caso de M. bovis, puesto que la eliminación de la secuencia anterior a la región de activación del espA (EAR) se traduce en una menor expresión de este gen. En consecuencia la variación de la expresión de ESX-1 en las distintas micobacterias del complejo tuberculosis, contribuye a la diversidad de patologías causadas y al diferente espectro de hospedadores (Hunt et al., 2012). La regulación del sistema de secreción ESX-1, debida a distintos sustratos y productos génicos, como EspA implica que su actividad podría estar controlada por la expresión transitoria de genes espACD, los cuales se expresarían temporalmente en el fagosoma macrofágico.

Las cepas de M. bovis y las de M. africanum (L6) presentan una deleción de la región de diferencia 8 (RFD8) (Gordon et al., 1999), así como varios SNPs situados inmediatamente delante del gen espACD, respecto del genoma de M. tuberculosis. Esta deleción en la Región de Diferencia 8 elimina los sitios de enlace para los productos  EspR y MprAB y también podría afectar a la expresión del gen espACD. Los elevados niveles encontrados de la expresión de este gen en animales infectados por M. bovis o por L6, sugieren que la expresión del operon espACD no está sujeta al control del PhoPR en esas cepas (Gonzalo-Asensio et al. 2014), como ya apuntábamos anteriormente. De todo ello puede deducirse que deterninadas mutaciones de los genes relacionados con el regulón PhoPR disminuyen la expresión de SL, PAT y Lípido F, moléculas implicadas en la de virulencia y que tanto M. bovis como M. africanum L6  tienen en menor proporción que M. tuberculosis. Sin embargo esas micobacterias pueden sufrir  mutaciones que compensan su falta de virulencia para humanos;  también en M tuberculosis podrían existir mutaciones en el bucle de control de la expresión del gen espACD, que constituirían una alternativa a la falta de virulencia  (Gonzalo-Asensio et al. 2014).

El sistema de regulación PhoPR es deficiente en las micobacterias adaptadas a animales (respecto de M. tuberculosis), debido a una mutación en el gen phoR. En el caso de la cepa L6 de M. africanum, la explicación de la disminución de virulencia, respecto a M, tuberculosis, radicaría en mutaciones del locus phoPR que habrían ocurrido en el antecesor común de M. bovis y M. africanum. Estas mutaciones afectarían a la síntesis y secreción de lípidos y proteínas y que supondrían una pérdida de capacidad patogénica para los humanos, aunque como se cita anteriormente una deleción en la región de diferencia 8 restablecería parcialmente su virulencia en humanos. Un lugar de elevada significación regulatoria, controlada por el regulón PhoP/R es el correspondiente a la región intergénica situada entre rv2395 y PE_PGRS41, donde se encuentra el gen mcr7, que codifica un pequeño segmento de ARN no codificante (ncARN) (Solans et al., 2014). Este gen existe solo en las micobacterias del complejo tuberculosis, aunque solo se expresa a un nivel elevado en las cepas de alta virulencia de M. tuberculosis sensu stricto, caso de la H37rv; habiéndose detectado su presencia, pero sin expresión fenotípica en M. africanum, M. bovis, M. caprae y M. microti. Solans y cols (2014), utilizando técnicas proteómicas, ponen de manifiesto que este mcr7 modula la acción del trasladador de proteínas tatC, sobre el ARNm (con lo que modula el sistema de secreción regulado por este transportador proteínico de doble arginina). El resultado es que el inmunógeno mayor complejo-Ag85 no se secreta, afectándose la beta-lactamasa C y permitiendo la secreción de ESAT-6. Todo ello permite relacionar el sistema regulador de dos components PhoP/R con los consecuentes sucesos inmunopatológicos, que dan lugar a una infección existosa por parte de M. tuberculosis.

El polimorfismo observado en el patrón de genes expresados, correspondientes a la pared micobacteriana está correlacionado con la secuencia de estos genes, conformando una importante fuente de variabilidad antigénica (Rehren et al., 2007). En todo caso la principal diferencia en el secretoma de ambas micobacterias es la elevada expresión en M. bovis de los dos antígenos mayores MPB70 y MPB83 (Hewinson et al., 1996). Tanto en M, tuberculosis como en M. bovis, estos antígenos se expresan bajo el control del gen sigK; la elevada expresión de estas proteínas en M. bovis es consecuencia de una mutación en el gen que codifica para la proteína anti-SigK (Charlet et al., 2005; Said-Salim et al., 2006). El análisis del gen mpb70 pone en evidencia la diferencia entre ambas micobacterias; también se observa una mayor expresión en M. bovis del gen mpb83, así como de sus genes vecinos dipZ  y Mb2901. Los genes ortólogos en M. tuberculosis  han sido identificados como miembros de un operon putativo (Juárez et al., 2001). Ambos genes son miembros del regulon SigK-RskA (Said-Salim et al., 2006). Ahora bien, aunque la expresión de mpb70 y mpb83 es baja en M. tuberculosis, aumenta considerablemente con la infección de los macrófagos, lo que sugiere una importante función de estas proteínas (Schnappinger et al., 2003; Said-Salim et al., 2006).

También se han observado patrones de expresión distintos para los genes responsables del transporte específico de fosfatos, en sendas micobacterias, correspondiente a la expresión de la proteína periplasmática de unión a fosfatos. Existen dos proteínas formadoras de canales transmembrana (PstA and PstC) que probablemente interactúan con una proteína citoplasmática de unión de ATP (PstB). El clúster de genes que codifican para esas proteínas está constituido por tres operones: pstS3 /pstC2 /pstA1, pstS2 /pknD  y pstB /pstS1 /pstC1 /pstA2 (Torres et al., 2001; Lefevre et al., 1997). Rehren et al., en 2007, observan que hay una mayor expresión del operon  pstS1/ pstC1/ pstA2 en M. tuberculosis; mientras que los genes  pstS3/ pstC2/ pstA1 se expresan mas en M. bovis. Por contra, otro gen, el pknD, igualmente implicado en la regulación del transporte de fosfato, está altamente expresado en M. tuberculosis, siendo un seudogen en M. bovis; lo cual implica la existencia de distintos mecanismos para la regulación del transporte del fosfato en sendas especies micobacterianas (Peirs et al., 2000).

Naturalmente también existen diferencias entre M. tuberculosis y M. bovis en cuanto a los genes implicados en la formación de lípidos constituyentes de la pared celular, lo cual tiene implicaciones en sus correspondientes virulencias, sobre todo cuando infectan a especies que no son sus hospedadores habituales. Así en M. bovis hay una mayor expresión de los genes  fadD26 y ppsA- D, que codifican para la ácido graso CoA ligasa y para la policetido-sintetasa, enzimas implicadas en la biosíntesis de los glicolípidos dimicocerosato de tiocerol (PDIM) y fenoltiocerol (PGLS) (Azad et al., 1997; Camacho et al., 2001). Estos PGLs no son producidos por todas las cepas de M. tuberculosis, lo cual se debe a cambios originados por mutaciones en el gen pks1 (Cosntant et al., 2002). Sin embargo las cepas de M. tuberculosis que producen GPLs son de alta virulencia (Reed et al., 2002; Tsenova et al., 2005).  Los genes pks2 y mmpl8 codifican una policetido sintetasa y un transportador de lípidos, respectivamente; ambos genes son precisos para la síntesis y el transporte de sulfolípido 1 (SL-1) detectado exclusivamente en  M. tuberculosis  y que está implicado en las interacciones patógeno/huésped (Converse et al., 2003; Sirakova et al., 2001)

El gen mce codifica las proteínas MCE (proteínas de entrada en células de mamíferos). La proteína MCE1 confiere a la micobacteria la facultad de entrar y sobrevivir en macrófagos y células de mamíferos (Arruda et al., 1993). Los genes mce forman parte de operones que contienen 8 genes cada uno: dos genes grbE, seguidos por 6 genes mce; M. tuberculosis contiene 4 locus para mce: mce1, mce2, mce3 y mce4; en M. bovis falta el mc3 (Zumárraga et al., 1999). Santangelo et al., en 2008, demuestran el papel regulador ejercido sobre la transcripción por MCE3R, ya que no solo controla la expresión del operon que contiene el gen mc3, sinó de otros genes que codifican para proteínas implicadas en el metabolismo de lípidos y en reacciones Redox.

En M. tuberculosis hay tres metaloproteasas zinc-dependientes. Por solo dos en M. bovis (Forrellad et al., 2013).

Los factores sigma sigB, sigE y sigH modifican la expresión de un subgrupo de genes necesarios para la adaptación al estrés in vivo (Manganelli et al., 2002). Existen cuatro genes sobreexpresados, en las fases anaeróbicas o hipóxicas (narG, cysH, nirA y fdhF) y otros cuya expresión cesa en condiciones aeróbicas. Podría deberse a que los regulones ejercen su función de manera independientes unos de otros, según el estado a que el medio ambiente induzca a la micobacteria (Hampshire et al., 1998). El principal factor sigma de micobacterias RpoV, es capaz de conferir virulencia a una  cepa de M. bovis atenuada (Gómez et al., 1998). M. tuberculosis codifica para trece factores sigma, siendo el principal el SigA (Forrellad, 2013). El gen sA codifica la proteína SigA (RpoV), que además de sobreexpresarse en condiciones de estrés, actúa también como regulador genético transcricional. El gen whiB3 produce la proteína WhiB3, miembro de la familia de reguladores WhiB3; esta proteína se une a SigA, lo que sugiere una concertación del control transcripcional, ejercido por ambos reguladores (Steyn, 2002). Lo hacen controlando la expresión de los genes pks2, pks3 y f6pA, involucrados en la síntesis de lípidos multirramificados (que favorecen la supervivencia de las micobacterias en el interior de los macrófagos humanos). Normalmente M. bovis no produce tantos lípidos de este tipo como M. tuberculosis, por lo que la acción del regulón WhiB3 resulta esencial en la supervivencia de esta micobacteria en macrófagos de la especie humana.

De especial interés son los reguladores de la transcripción, que permiten la adaptación de la micobacteria a los distintos ambientes, mediante la regulación de la transcripción de un grupo de genes determinado. Así M. tuberculosis sobreexpresa los genes rv2160c y rv0232, los cuales codifican el regulador transcripcional de la familia TetR/AcrR.  Sin embargo en M. bovis se sobreexpresan 7 genes, entre ellos el whiB6 (que tiene una penetración fenotípica de 30'5 veces, respecto a M. tuberculosis) (Rehen et al., 2007). Así mismo los otros miembros de la familia génica whiB, los whiB3 y whiB4 tienen una expresión en M. bovis de 2'7 y 2'9 veces mayor que en M. tuberculosis; por contra el whoB1 penetra 2'6 veces mas en M. tuberculosis que en M. bovis (Rehnen et al., 2007). Estos autores afirman que esta regulación diferencial contribuiría a la expresión de los diferentes fenotipos observados en sendas micobacterias.

Las deleciones genómicas detectadas en una micobacteria respecto de la otra, corresponderían a la diferente evolución que han sufrido los distintos miembros del complejo tuberculosis (Gordon et al., 1999; Brosch et al., 2002). Rehnen et al., (2007), detectan en M. tuberculosis la expresión de 31 genes, que asientan en las RDs 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 13, pero para los cuales existe deleción en el genoma de M. bovis. Esos genes serían responsables de distintos factores de virulencia y por lo tanto responsables del fenotipo; entre ellos están los reponsables de la fosfolipasa C, profagos, relacionados con ESAT-6 y de la familia de proteínas PE. Por contra, en M. bovis se detectan 5 genes en la región RvD que codifican para un transportador transmembrana de proteínas, dos proteínas y un cofactor-dependiente de molibdeno para la síntesis de proteína, así como un regulador transcripcional (Rehnen et al., 2007). Hay dos deleciones funcionales para todos los miembros del complejo tuberculosis; así la deleción de RD1 juega un papel en la atenuación de M. bovis BCG (Pym et al., 2002).

La evolución ha permitido, en base a posteriores mutaciones adicionales, la aparición de otras especies micobacterianas del complejo tuberculosis, que afectan a distintos animales (Smith et al., 2009). También se ha aislado en humanos una cepa B de M, bovis, que resulta altamente patógena para nuestra especie. Esto es debido a la presencia de un elemento móvil insertado por delante del locus phoPR, lo que determina la sobreexpresión de este y se traduce en su transmisión por aerosoles entre humanos con el consecuente desarrollo de TBC pulmonar activa en los individuos de esta especie (Rivero et al., 2001; González-Asensio et al., 2014). Este factor de virulencia en M. bovis para la especie humana, lo constituye el elemento de inserción 6110 (IS6110), dependiendo del nº de copias de este elemento presentes en el genoma de M. bovis (Benítez, 2015). Esto se ha observado en condiciones de campo con un brote de TBC humana debido a M. bovis en España (Buchmeier et al., 2000; Gonzalo-Asensio et al., 2014). La presencia del segmento de inserción 6110 en M. bovis, determina un incremento de la virulencia de esta micobacteria, de modo que posibilita el contagio horizontal entre humanos infectados (Rivero et al., 2001). Esto parece ser debido a que dicho segmento de inserción suple las deficiencias para la expresión de genes que tiene el gen phoPR-bovis, respecto a su gen homólogo en M. tuberculosis (Gonzalo Asensio et al., 2014). Algunas cepas de M. tuberculosis llegan a presentar hasta 25 copias. M. bovis presenta algunas limitaciones, siendo lo habitual en esta micobacteria entre una y cinco copias; comúnmente localizadas en el locus DR (Aranaz et al., 1998; Acosta-salinas et al., 2009). En las cepas de M. bovis que únicamente tienen una copia de este elemento móvil, IS6110 está insertada en el DR localizado entre los espaciadores 24 y 25 (Kamerbeek et al., 1997) (repetido en bases moleculares)

No es bien conocido el mecanismo por el que la presencia de IS6110 incrementa la virulencia de los miembros del  Mycobacterium tuberculosis complex. La inserción de IS6110 en regiones codificantes puede dar lugar a  pérdida de actividad génica, mientras que la recombinación homóloga entre dos copias de IS6110 puede originar deleción de genes o reordenación de las regiones genómicas implicadas. Como consecuencia de esos cambios genómicos IS6110 puede provocar la expresión de  genes colindantes, actuando como un promotor móvil. Los aislamientos de M. bovis a partir de humanos holandeses portadores de este elemento de inserción transponible, corresponden a casos de reactivación endógena de TBC, en individuos mayores. Su estudio puso en evidencia que de los 12 lugares de inserción encontrados, 6 loci estaban localizados en regiones intergénicas y otros 6 en regiones codificantes, pudiendo actuar como promotor en al menos 2 casos. Es decir las transposiciones del IS6110 son una forma de adaptación del M. bovis a la especie humana (Otal et al, 2009).

AGRADECIMIENTOS

El autor agradece al Pf. Dr. Don Javier Hermoso de Mendoza y Salcedo su colaboración en la supervisión de la versión final de este texto.

 

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